Potencial antibacteriano de un enjuague bucal a base de Azadirachta indica (neem) sobre patógenos orales

Miguel Angel Ruiz-Barrueto; Wilfredo Terrones-Campos; Daniela Alejandra Cueva-Yesán; María Félix Sánchez-Villavicencio; José Elías Cabrejo-Paredes

Potencial antibacteriano de un enjuague bucal a base de Azadirachta indica (neem) sobre patógenos orales

Artículo de investigación

Potencial antibacteriano de un enjuague bucal a base de Azadirachta indica (neem) sobre patógenos orales

Antibacterial potential of a mouthwash based on Azadirachta indica (neem) on oral pathogens

Miguel Angel Ruiz-Barrueto¹* https://orcid.org/0000-0002-3373-4671
Wilfredo Terrones-Campos ² https://orcid.org/0000-0002-4818-5855
Daniela Alejandra Cueva-Yesán³ https://orcid.org/0000-0002-2692-3976
María Félix Sánchez-Villavicencio ⁴ https://orcid.org/0000-0003-2036-0110
José Elías Cabrejo-Paredes⁵ https://orcid.org/0000-0002-7335-0541

¹Universidad César Vallejo. Escuela Profesional de Estomatología. Piura, Perú.
²Universidad Nacional de Piura. Escuela Profesional de Estomatología. Piura, Perú.
³Centro de Salud La Cruz. Departamento de Odontología. Tumbes, Perú.
⁴Universidad Nacional Agraria de La Selva. Facultad de Informática y Sistemas. Tingo María, Perú.
⁵Universidad Nacional de Trujillo. Facultad de Medicina. Trujillo, Perú.

*Autor para la correspondencia. Correo electrónico: mruizb@ucv.edu.pe

RESUMEN

Introducción: La alta prevalencia de enfermedades orales y los efectos colaterales de los fármacos sintéticos ha impulsado el estudio de alternativas terapéuticas como las plantas medicinales que sean seguras, efectivas y económicas para la población.
Objetivo: Evaluar el potencial antibacteriano de 2 enjuagues bucal a base de Azadirachta indica (neem) sobre Streptococcus mutans y Enterococcus faecalis.
Métodos: Estudio experimental. Se elaboraron 2 enjuagues bucales del extracto hidroetanólico de neen con concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL. El potencial antibacteriano se evaluó por el método de difusión en disco. Los datos fueron analizados con ANOVA y Tukey en el paquete estadístico SPSS v.26.
Resultados: Para Streptococcus mutans el halo del enjuague bucal con 25 mg/mL de extracto de neem fue de 25,12 ± 0,798 mm; el de 50 mg/mL formó un halo de 29,40 ± 1,197 mm; el control negativo un halo de 8,62 ± 0,132 mm y la clorhexidina 0,12 % un halo de 17,64 ± 0,160 mm. Para Enterococcus faecalis, el halo del enjuague bucal con 25 mg/mL fue de 18,23 ± 1,150 mm; el de 50 mg/mL un halo de 20,93 ± 0,487 mm; el control negativo un halo de 7,91 ± 0,417 mm y la clorhexidina 0,12 % un halo de 16,50 ± 0,505 mm.
Conclusión: Los enjuagues bucales a base de neem presentan potencial antibacteriano in vitro sobre Streptococcus mutans y Enterococcus faecalis y podrían ser utilizados en un futuro en su control y el de otros patógenos orales.

Palabras clave: antibacterianos; extractos vegetales; Azadirachta ; Streptococcus mutans; Enterococcus faecalis; antisépticos bucales.

ABSTRACT

Introduction: The high prevalence of oral diseases and the side effects of synthetic drugs has promoted the study of therapeutic alternatives such as medicinal plants that are safe, effective and economical for the population.
Objective: To evaluate the antibacterial potential of 2 mouthwashes based on Azadirachta indica (neem) on Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis.
Methods: Experimental study. Two mouthwashes were made from the hydroethanolic extract of neen with concentrations of 25 mg/mL and 50 mg/mL. The antibacterial potential was evaluated by the disk diffusion method. The data were analyzed with ANOVA and Tukey in the statistical package SPSS v.26.
Results: For Streptococcus mutans, the halo of the mouthwash with 25 mg/mL of neem extract was 25.12 ± 0.798 mm; that of 50 mg/mL formed a halo of 29.40 ± 1.197 mm; the negative control a halo of 8.62 ± 0.132 mm and chlorhexidine 0.12% a halo of 17.64 ± 0.160 mm. For Enterococcus faecalis , the halo of the mouthwash with 25 mg/mL was 18.23 ± 1,150 mm; that of 50 mg/mL a halo of 20.93 ± 0.487 mm; the negative control a halo of 7.91 ± 0.417 mm and chlorhexidine 0.12% a halo of 16.50 ± 0.505 mm.
Conclusion: Neem-based mouthwashes have in vitro antibacterial potential against Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis and could be used in the future to control them and other oral pathogens.

Keywords: antibacterials; vegetable extracts; Azadirachta; Streptococcus mutans; Enterococcus faecalis; oral antiseptics.

Recibido: 15/09/2022
Aprobado: 11/04/2023

INTRODUCCIÓN

La caries dental debido a su alta prevalencia sigue siendo en la actualidad un problema de salud pública mundial.⁽¹⁾ Streptococcus mutans (S. mutans) es considerado un microorganismo cariogénico y la principal bacteria asociada al inicio y progreso de esta enfermedad.⁽²⁾Los ácidos producto del metabolismo de los carbohidratos remanentes de la dieta desgastan el esmalte y desencadenan la pérdida de estructura dentaria.⁽³⁾Los dientes son una parte importante del cuerpo humano; su ausencia afecta la salud oral, la salud general y mental del individuo, así como su capacidad para socializar.⁽⁴⁾

De igual forma, la principal causa de las infecciones endodónticas, es la presencia de microorganismos. El patógeno oportunista más frecuentemente aislado en estas infecciones es Enterococcus faecalis (E. faecalis).⁽⁵⁾ Esta bacteria anaerobia facultativa puede sobrevivir sin nutrientes y en presencia de fármacos e irrigantes intracanales debido a la facilidad para adquirir resistencia a los antibióticos, crecer a pH alcalino, tolerar rangos amplios de temperatura. Tiene la capacidad para invadir los túbulos dentinarios, utilizar fluidos del ligamento periodontal y suero como nutrientes y adherirse al colágeno, además de otros factores de virulencia que le permiten sobrevivir en condiciones desfavorables y lo hacen difícil de eliminar.^(6,7)

Las prácticas preventivas y el tratamiento de las principales enfermedades orales, incluyen la higiene bucal mecánica y la utilización de productos complementarios de higiene oral, como los enjuagues bucales que pueden contener compuestos antimicrobianos que eliminan a los microorganismos de las placas dentales.⁽⁸⁾ La actividad antibacteriana de los enjuagues bucales es una ventaja, pues su naturaleza permite que llegue a zonas donde otros elementos no podrían. Independientemente de la marca del producto, el principal componente antimicrobiano colocado en la formulación siempre es una sustancia química.⁽⁹⁾

Debido al incremento acelerado de la resistencia a los antimicrobianos y la perspectiva limitada del descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos sintéticos, el uso efectivo de antimicrobianos en el futuro es incierto.⁽¹⁰⁾ Por ello, es primordial investigar nuevas fuentes alternativas de compuestos bioactivos, eficaces y seguros para la población.⁽¹¹⁾ Teniendo en cuenta que las plantas medicinales se han utilizado para curar diversas enfermedades durante siglos, una de estas nuevas opciones son los medicamentos a base de plantas medicinales, que podrían ser una buena opción debido a la seguridad, la biodegradabilidad y la imposición de menos efectos secundarios.⁽¹²⁾

La medicina complementaria y alternativa recomienda numerosos enjuagues bucales a base de plantas medicinales, para el control de diversas enfermedades orales.⁽¹³⁾ A pesar que ya se ha probado la eficacia antibacteriana de diversas plantas medicinales autóctonas y adaptadas al territorio peruano, los enjuagues bucales a base de productos vegetales están limitados a unos pocos extractos y aceites esenciales.⁽⁸⁾ En ese contexto, Azadirachta indica (neem) es una especie vegetal bien conocida en el mundo, por su gran potencial etnofarmacológico. El neem como comúnmente se le denomina, se desarrolla bien en diversas partes del país. Algunos estudios^(14,15) dan cuenta que el azadirachtin y los flavonoides polifenólicos purificados de hojas de neem, son los principales responsables de su potencial antibacteriano.

Al respecto, se ha reportado que el extracto de hojas de neem tiene actividad antimicrobiana contra bacterias grampositivas y gramnegativas. Se logró identificar que el beta-d-mannofuranoside y el o-geranyl son los compuestos con mayor actividad antimicrobiana.⁽¹⁶⁾ También se ha establecido que la catequina es el compuesto bioactivo de A. indica (neem) más eficiente con actividad antibiopelícula y antiquorum de E. faecalis y Porphyromonas gingivalis, evita que estas bacterias se protejan entre sí en presencia de oxígeno. Este compuesto natural podría ser utilizado como fármaco en el tratamiento de infecciones crónicas asociadas a la biopelícula dental.^(17,18)

El objetivo de la presente investigación es evaluar el potencial antibacteriano in vitro de 2 enjuagues bucales del extracto hidroetanólico de hojas de A. indica (neem), con concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL sobre cepas de referencia de Streptococcus mutans ATCC^®35668 ^TM y Enterococcus faecalis ATCC^®29212 ^TM.

MÉTODOS

La investigación fue de tipo básica, de enfoque cuantitativo con diseño experimental in vitro. La muestra fue calculada en el programa G*Power v. 3.1.9.7⁽¹⁹⁾ y estuvo constituida por placas Petri sembradas con cepas estandarizadas de S. mutans ATCC^®35668 ^TM y E. faecalis ATCC^®29212^TM. Se realizaron 19 repeticiones por cada enjuague bucal, según la concentración de extracto y tipo de bacteria, lo que hizo un total de 152 unidades experimentales. La ejecución se realizó en los laboratorios del Instituto de Investigación en Ciencia y Tecnología de la Universidad César Vallejo en la ciudad de Trujillo, Perú.

Obtención del extracto hidroetanólico

El material vegetal, principalmente hojas frescas, se recolectaron en la provincia de Piura, Perú, durante el mes de enero del 2022, en una cantidad aproximada de 1 kg. Las muestras vegetales se identificaron taxonómicamente como Azadirachta indica Jussieu 1830 MELIACEAE "neem" en el Herbariun Piurense con registro No. 0004-2022. Las hojas fueron seleccionadas, lavadas con agua corriente, desinfectas con alcohol al 70 % y posteriormente secadas en estufa a 40 ^oC durante 30 horas. El material vegetal seco y molido fue empaquetado en papel de filtro Whatman® grado 1 y colocado en un sistema Soxhlet, para la obtención del extracto hidroetanólico. Una vez obtenido el extracto total fue concentrado y secado en rotavapor Isolab® y almacenado en refrigeración en un frasco de vidrio ámbar hasta su utilización. Las concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL se prepararon al momento de la experimentación utilizando como diluyente dimetilsulfóxido (DMSO) al 1 %.

Preparación de enjuagues bucales herbales a base de neem

Se prepararon 2 enjuagues bucales a los cuales se les incorporó las concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL del extracto hidroetanólico de neem. Dichas concentraciones son estándares para la evaluación toxicológica de productos naturales. La fórmula unitaria para 80 mL fue la siguiente; emal (Polioxietileno lauril éter sulfato de sodio) 70; al 3,75 %, 3 g, glicerina al 18,38 %, 14,7 g, sorbitol al 5,63 %, 4,5 g, sacarina al 0,04 %, 0,032 g y 10 mL de extracto de neem a concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL, agua al 33,88 % c.s.p., 80 mL.

Reactivación de cepas y estandarización del inóculo bacteriano

Las cepas certificadas y liofilizadas fueron adquiridas de la empresa GenLab Perú S.A.C. La reactivación se realizó según recomendaciones del fabricante en caldo Müller-Hinton (Millipor^®, Alemania) para Streptococcus mutans ATCC^®35668 ^TM y en caldo Infusión Cerebro Corazón (Millipor®, Alemania) para Enterococcus faecalis ATCC^®29212^TM; 24 horas antes de la evaluación en condiciones de aerobiosis a 36,5 ^oC en incubadora microbiológica Memmert^®. La estandarización del inóculo de ambas bacterias se realizó por turbidimetría en espectrofotómetro Thermo Scientific ^® Genesys 150 y ajustado a la escala McFarland de 0,5 equivalente a 1,5x10 ⁸ UFC/mL.

Evaluación del potencial antibacteriano por el método de difusión en disco

El efecto antibacteriano de los extractos fue determinado por el método estandarizado de difusión en disco según el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).⁽²⁰⁾ A partir del inóculo estandarizado se incorporaron 200 µL de la suspensión bacteriana a superficies de placas Petri con Mitis Salivarius Agar (Millipor®, Alemania). Se colocaron 4 discos de papel de filtro Whatman N ^o 3 de 6 mm de diámetro cargados con cada volumen de enjuague bucal según concentración y sustancia a evaluar. Los discos fueron colocados sobre las placas inoculadas con cada una de las bacterias y fueron incubadas durante 24-48 horas a 36,5 ^oC en microaerofilia. Después del periodo de incubación se realizó la medición de los diámetros de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano expresados en milímetros con un calibrador mecánico Starrett^®.

Análisis estadístico

Los datos correspondientes a los diámetros de halos de inhibición fueron analizados en el paquete estadístico SPSS v.26.0 Se realizaron pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk y análisis de varianza (ANOVA). La significación estadística se estableció mediante el análisis post hoc de Tukey (p= 0,05).

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestran los resultados promedios del diámetro de las zonas de inhibición generados por los enjuagues bucales a base de 25 mg/mL y 50 mg/mL de extracto hidroetanólico de neem sobre S. mutans ATCC^®35668^TM. Los resultados muestran diferencias estadísticamente significativas entre todos los tratamientos evaluados (p< 0,05). La efectividad de los enjuagues bucales con 25 mg/mL y 50 mg/mL de extracto hidroetanólico de neem fue superior al del control positivo clorhexidina 0,12 %.

En la tabla 2 se observan los promedios de diámetros de las zonas de inhibición de los enjuagues bucales a base de 25 mg/mL y 50 mg/mL de extracto hidroetanólico de neem sobre E. faecalisATCC^®29212^TM. Se aprecian diferencias estadísticamente significativas en la mayoría de tratamientos evaluados (p< 0,05), excepto entre la clorhexidina 0,12 % y el enjuague bucal con 25 mg/mL de neem. Ver figura 1 (Ver en alta definición).

DISCUSIÓN

La microbiota oral que incluye bacterias benéficas y patógenas juega un papel crucial en la homeostasis y en el mantenimiento de la salud oral y el bienestar general del ser humano. Sin embargo, una vez que se rompe este equilibrio, con predominio de patógenos, estos pueden conducir a una variedad de enfermedades orales, como la caries dental, en cuyo inicio y progreso Streptococcus mutans participa de manera activa.⁽¹⁾ Por otra parte, Enterococcus faecalis es uno de los principales responsables del fracaso del tratamiento endodóntico en los casos de periodontitis apical crónica no supurativa.⁽⁵⁾Su permanencia en el conducto radicular se asocia a su resistencia natural a diversos irrigantes intracanal y a la capacidad de sobrevivir en ambientes hostiles mediante la formación de biopelículas con otros microorganismos.⁽⁶⁾

Esta realidad obliga a desarrollar nuevas alternativas farmacológicas derivadas de plantas medicinales como Azadirachta indica A. Juss (neem), que es una hierba medicinal originaria de la India, pero que crece bien en la mayoría de los países tropicales y subtropicales, incluidos el Perú; de la cual se han aislado con éxito más de 140 compuestos bioactivos, ha sido utilizada en la medicina tradicional y complementaria durante miles de años, y no se han reportado efectos secundarios debido a su utilización. Estudios precedentes,^{(14,15,16,17)} destacan su potencial antimicrobiano, entre muchos otros efectos. Su principio activo más importante es la azadiractina, sin embargo, también contiene limonoides tipo tetranortriterpenoides, quercetina, sitosterol, flavonoides polifenólicos, principalmente en las hojas de la planta, a los que se les atribuye sus propiedades antibacterianas y antifúngicas. Al respecto, Lu y otros,⁽²¹⁾ evaluaron la actividad antibacteriana de 15 tipos de limonoides extraídos de semillas de neem. Informan que el compuesto 17ß-hidroxinimbocinol y el 2,3-dihidronimbolida muestran actividad inhibitoria contra E. coli y moderada contra Staphylococcus epidermidis; mientras que, el 6-homodesacetilnimbina y el nimbineno inhiben el crecimiento deEscherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.

Se ha indicado que la técnica de extracción y el solvente utilizado para la recuperación de biocompuestos de plantas medicinales, son relevantes en la evaluación del efecto terapéutico de un producto vegetal, pues influirían en la cantidad de los compuestos bioactivos recuperados. Al respecto, Kalita y otros⁽²²⁾determinaron el potencial antibacteriano del extracto de neem y otras plantas contra E. faecalis; lograron establecer que el extracto acetónico muestra mayor eficacia antibacteriana que el extracto acuoso. Por su parte, Altayb y otros,⁽¹⁶⁾ y Arévalo-Híjar y otros,⁽²³⁾ comunican que el extracto metanólico de neem tiene actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, E. coli y E. faecalis. Además, se identificó a O-geraniol un Beta d-manofuranósido como un agente antibacteriano prometedor, para el control de microorganismos de interés estomatológico y médico.⁽¹⁶⁾

Sin embargo, al parecer este no es el único compuesto con alto potencial antibacteriano presente en el extracto de neem, pues Lahiri y otros,⁽¹⁷⁾compararon el potencial antiplaca de la quercetina, la nimbolida, la nimbina y la azardiractina; reportan que la catequina fue el compuesto bioactivo más eficiente de A. indica con actividades antibiopelícula y antiquórum de la biopelícula dental formada por Porphyromonas gingivalis y Alcaligenes faecalis. Esto se corrobora con lo señalado por Heyman y otros,⁽²⁴⁾ quienes reportan que la actividad antibacteriana del extracto de neem sobre P. gingivalis y Fusobacterium nucleatum es dependiente de la concentración.

Estos resultados no solo corroboran la efectividad antibacteriana de los principios activos presentes en el extracto de neem sobre bacterias patógenas orales, sino también, sobre bacterias resistentes a los antibióticos, tal como lo señalaron Aliy otros⁽²⁵⁾y Zihadi y otros,⁽²⁶⁾al establecer que el extracto de hojas de neem a concentraciones de entre 12,5 mg/mL y 112,5 mg/mL muestran efecto inhibitorio y bactericida sobre diferentes especies de Salmonella, Pasteurella multocida, S. aureus y E. coli resistentes a múltiples fármacos.

Se ha demostrado que la capacidad antibacteriana del extracto de neem reportada en diversas investigaciones se mantiene cuando dichos productos herbales son incorporados en formulaciones como enjuagues bucales, colutorios e irrigantes. Esto se fundamenta también en los estudios de Singh y otros,⁽²⁷⁾ quienes revelan que las tabletas de enjuague bucal efervescente a base neem muestran buen potencial antibacteriano sobre S. mutans y en el mantenimiento de la higiene bucal, en comparación a los enjuagues bucales que contienen alcohol. Por su parte, Joy y otros,⁽²⁸⁾ reportan que el efecto antibacteriano del neem como irrigante endodóntico sobre E. faecalis fue similar al de la clorhexidina y superior al de otros productos comerciales.

De manera similar, Kumari y otros,⁽²⁹⁾establecen que la incorporación de extractos de neem en nuevos materiales de tratamiento restaurador atraumático, muestran actividad antibacteriana considerable contra S. mutans. Esto se correlaciona con lo reportado por Dhingray otros,⁽³⁰⁾quienes informan que la efectividad de un enjuague bucal herbal preparado con neem, para controlar la placa dental y la salud gingival, fue similar al que se obtiene con la clorhexidina cuando se emplea después del cepillado en pacientes con enfermedad periodontal inicial.

Se concluye que los enjuagues bucales preparados con las concentraciones de 25 mg/mL y 50 mg/mL de extracto hidroetanólico de hojas de Azadirachta indica (neem) presentan potencial antibacteriano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC^®35668 ^TM y Enterococcus faecalis ATCC^®29212^TM, superior al de la clorhexidina 0,12 %.

Se recomienda a la comunidad científica continuar investigando el potencial antimicrobiano de Azadirachta indica (neem) a fin de que a mediano plazo sus compuestos bioactivos puedan ser utilizados para el control de microorganismos de interés estomatológico y como producto complementario en la higiene oral.

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Conflictos de interés

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Contribuciones de los autores

Conceptualización: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones-Campos.
Curación de datos: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones-Campos.
Análisis formal: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, María Félix Sánchez-Villavicencio.
Adquisición de fondos: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Wilfredo Terrones-Campos, José Elías Cabrejo-Paredes.
Investigación: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones Campos.
Metodología: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, María Félix Sánchez-Villavicencio.
Administración del proyecto: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Wilfredo Terrones-Campos, José Elías Cabrejo-Paredes.
Recursos: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones-Campos, José Elías Cabrejo-Paredes.
Software: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, María Félix Sánchez-Villavicencio.
Supervisión: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, José Elías Cabrejo-Paredes.
Validación: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, María Félix Sánchez-Villavicencio.
Visualización: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones-Campos.
Redacción - borrador original: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, Wilfredo Terrones-Campos, José Elías Cabrejo-Paredes.
Redacción - revisión y edición: Miguel Angel Ruiz-Barrueto, Wilfredo Terrones-Campos, Daniela Alejandra Cueva-Yesán, María Félix Sánchez-Villavicencio, José Elías Cabrejo-Paredes.

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