Efecto antibacteriano de dos extractos hidroalcohólicos de plantas medicinales sobre Streptococcus mutans

Héctor Alexander Vílchez Cáceda; Ketty Rojas Berastein; Antonella Rosario Olortegui Quispe; Christhian Alexander Alvia Saldarriaga

Efecto antibacteriano de dos extractos hidroalcohólicos de plantas medicinales sobre Streptococcus mutans

Artículo de investigación

Efecto antibacteriano de dos extractos hidroalcohólicos de plantas medicinales sobre Streptococcus mutans

Antibacterial effect of two hydroalcoholic extracts of medicinal plants on Streptococcus mutans

Héctor Alexander Vilchez Cáceda¹* https://orcid.org/0000-0001-7094-0821
Ketty Rojas Berastein² https://orcid.org/0000-0001-8521-5737
Antonella Rosario Olortegui Quispe² https://orcid.org/0000-0001-7900-0756
Christhian Alexander Alvia Saldarriaga³ https://orcid.org/0000-0002-5611-9655

¹Universidad Científica del Sur. Lima, Perú.
²Universidad Inca Garcilaso de la Vega. Lima, Perú.
³Universidad María Auxiliadora. Lima, Perú.

*Autor para la correspondencia. Correo electrónico: hvilchez@cientifica.edu.pe

RESUMEN

Introducción: Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth (ollamepan) e Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel (bellaco caspi) presentan metabolitos secundarios con capacidad de inhibir cepas de Streptococcus mutans, responsable del desarrollo de caries dental.
Objetivos: Evaluar el efecto antibacteriano de los extractos hidroalcohólicos de ollamepan y bellaco caspi sobre Streptococcus mutans.
Métodos: Estudio experimental, in vitro y comparativo. Se realizó un ensayo fitoquímico preliminar de ambos extractos. Se utilizaron 60 placas de agar Müller-Hinton (Merck^®), repartidas en 4 grupos (n= 15): grupo I (etanol al 70 %), grupo II (clorhexidina al 0,12 %), grupo III (ollamepanal 25 %), grupo IV (bellaco caspi al 25 %). Se empleó la técnica de difusión con discos descrita por Bauer y Kirby; la cepa utilizada fue Streptococcus mutans ATCC 25175 y las mediciones de los diámetros de inhibición se realizaron a las 24 h, para precisar el efecto antibacteriano.
Resultados: En el ensayo fitoquímico se detectaron compuestos fenólicos y taninos en ambos extractos. Se confirmó el efecto antibacteriano del grupo III con 18,660 ± 0,0948 mm (95,54 %) y grupo IV con 19,383 ± 0,0845 mm (99,24 %), comparables con clorhexidina al 0,12 % (grupo II) 19,532 ± 0,0975 mm (100 %) sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.
Conclusiones: Los extractos hidroalcohólicos de ambas especies tienen efecto antibacteriano in vitro sobre cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175. Sin embargo, Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel al 25 % presenta efecto antibacteriano con valores semejantes a clorhexidina al 0,12 %.

Palabras clave: Apocynacea; caries dental; clorhexidina; Hyptis;Streptococcus mutans.

ABSTRACT

Introduction: Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth (ollamepan) and Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel (bellaco caspi) present secondary metabolites with the capacity to inhibit strains of Streptococcus mutans, responsible for the development of dental caries.
Objectives: To evaluate the antibacterial effect of hydroalcoholic extracts of ollamepan and bellaco caspi on Streptococcus mutans.
Methods: Experimental, in vitro and comparative study. A preliminary phytochemical assay of both extracts was performed. Sixty Müller-Hinton agar plates (Merck®) were used, divided into 4 groups (n= 15): group I (70% ethanol), group II (0.12% chlorhexidine), group III (25% ollamepan), group IV (25% bellaco caspi). The disc diffusion technique described by Bauer and Kirby was used; the strain used was Streptococcus mutans ATCC 25175 and the inhibition diameters were measured at 24 h to determine the antibacterial effect.
Results: In the phytochemical assay, phenolic compounds and tannins were detected in both extracts. The antibacterial effect of group III was confirmed with 18.660 ± 0.0948 mm (95.54%) and group IV with 19.383 ± 0.0845 mm (99.24%), comparable with 0.12% chlorhexidine (group II) 19.532 ± 0.0975 mm (100%) on Streptococcus mutans ATCC 25175.
Conclusions: Hydroalcoholic extracts of both species have antibacterial effect in vitro on Streptococcus mutans ATCC 25175 strains. However, Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel at 25% shows antibacterial effect with values similar to chlorhexidine at 0.12%.

Keywords: Apocynaceae; clorhexidine; dental caries; Hyptis; Streptococcus mutans .

Recibido: 25/02/2023
Aprobado: 04/05/2023

INTRODUCCIÓN

La cavidad oral presenta un complejo ecosistema formado por diversas especies bacterianas, las cuales están relacionadas con las enfermedades odontológicas más frecuentes.⁽¹⁾ De ellas, la caries dental es la de mayor prevalencia y distribución mundial; su principal agente etiológico es Streptococcus mutans, que al producir ácido láctico provoca un descenso del pH y ocasiona la ruptura del esmalte dental. Además inhibe el crecimiento de otras bacterias y forma una biopelícula que le provee protección contra los antibióticos.⁽²⁾

Según cifras de la Organización Mundial de la Salud (OMS),⁽³⁾ la caries dental afecta a 2000 millones de personas en el mundo; los niños son los más afectados, con una prevalencia de 514 millones. Asimismo, el Ministerio de Salud de Perú,⁽⁴⁾ refiere que la incidencia de caries dental es del 90,4 %.Por estas cifras se requiere mitigar el sobre desarrollo de S. mutans, para lo cual se estudian diferentes extractos de origen natural, sintético o semisintético con propiedades antibacterianas para mantener la salud bucal.⁽²⁾

Perú se distingue por su gran biodiversidad⁽⁵⁾ y el empleo de una gama de plantas de forma empírica desde la antigüedad, para el tratamiento de distintas enfermedades, incluída la caries dental.^(6,7) Diferentes investigadores,^(8,9,10) han demostrado la capacidad que poseen ciertos metabolitos secundarios, aislados de extractos de especies vegetales, los cuales tienen propiedades antibacterianas a través de distintos mecanismos de acción.

Existen diversos tipos de enjuagues bucales, los cuales se utilizan como complemento después de la limpieza mecánica de las piezas dentales, para prevenir la placa dental y la subsecuente aparición de caries.⁽¹¹⁾ Sin embargo, su uso frecuente puede ocasionar cambios en la coloración de la dentadura, alteración del gusto y ardor de la mucosa.⁽¹²⁾ Por esta razón se requiere desarrollar investigaciones que se enfoquen en la búsqueda de alternativas en la medicina natural.⁽¹³⁾

Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth (ollamepan), pertenece a la familia Lamiaceae, cuyos miembros se utilizan con frecuencia con fines antimicrobianos;⁽¹⁴⁾ su género consta de 290 especies diseminadas en las regiones tropicales y templadas de América.⁽¹⁴⁾ Estudios realizados por De Oliverira y otros,⁽¹⁵⁾ Cahyono y otros,⁽¹⁶⁾ y Prado y otros,⁽¹⁷⁾ han demostrado que el género Hyptis presenta propiedades antibacterianas, incluso sobre Streptococcus mutans.

Himatanthus tarapotensis (K. Schum. Ex Markgr.) Plumel (bellaco caspi), pertenece a la familia Apocynaceae, el género Himatanthus incluye alrededor de 13 especies distribuidas en América del Sur.⁽¹⁸⁾ Los estudios de Barbosa y otros,⁽¹⁹⁾ y Souza y otros,⁽²⁰⁾ denotan que el género presenta efecto antibacteriano.

El objetivo de la investigación es evaluar el efecto antibacteriano de los extractos hidroalcohólicos de Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel e Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth sobre Streptococcus mutans ATCC 25175.

MÉTODOS

Se realizó una investigación experimental, in vitro y comparativa en el laboratorio de investigación y desarrollo farmacéutico de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, durante los meses comprendidos entre febrero del 2019 y marzo del 2020.

La recolección de las muestras fue aleatorizada en las zonas de siembra; corteza de bellaco caspi en el distrito de Nauta, provincia de Loreto de la región Loreto a 104 metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.); hojas de ollamepan de la localidad de Amaybamba, provincia Quillabamba, departamento del Cusco a una altura de 1650 m.s.n.m. La identificación taxonómica se realizó en el Herbarium Amazonense, AMAZ-CIRNA de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana.

Las muestras fueron limpiadas, lavadas con agua desionizada estéril y clasificadas.^(21,22) Las hojas y cortezas se trozaron con un cuchillo de acero inoxidable, a continuación, se procedió a secarlas a 40 °C por 90 horas (hojas) y 140 horas (cortezas), para ser posteriormente trituradas en molino de acero quirúrgico común.^(21,22,23) Los extractos hidroalcohólicos se obtuvieron mediante el método de maceración en 3500 mL de etanol al 70 % y 500 g de cada muestra durante 10 días con agitación cada 12 h,^(21,22,23) después se filtraron con papel Whatman Nº 40 y se ubicaron en una estufa (Memmert^®) a 40 °C ± 2 ºC hasta eliminar el solvente y alcanzar un peso seco constante, con lo cual se obtuvieron 120 g (hojas) y 140 g (cortezas) de extracto seco. A continuación se prepararon diluciones con etanol al 70 % hasta obtener concentraciones al 25 % de ambas muestras.^(21,22,23)

Los metabolitos secundarios se detectaron por medio del ensayo fitoquímico preliminar, por procedimientos químicos de reacción por coloración y precipitación, como las de espuma (saponinas), gelatina-sal (taninos), molish (hidrato de carbono), Shinoda (flavonoides), ninhidrina (aminoácidos libres), Lieberman-Burchard (esteroides), Dragendorff (alcaloides), Bornträger (quinonas), Rosenheim (antocianinas), tricloruro férrico (compuestos fenólicos), Baljet y legal (lactonas sesquiterpénicas) y KOH 0,5M y UV (cumarinas).⁽⁵⁾

La reactivación de Streptococcus mutans (ATCC 25175) se ejecutó teniendo en cuenta los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),⁽²⁴⁾ se usó el agar Müller-Hinton (Merck^®),⁽²⁵⁾ para obtener colonias bien separadas se realizó la técnica de siembra por estrías escocesas, se trasladaron los medios de cultivo a una incubadora (Memmert^®) en posición invertida a 36,5 °C por 24 horas.⁽²⁶⁾Para la preparación del inóculo y posterior estandarización se siguió lo declarado por Vilchez y otros.⁽²⁶⁾

El estudio in vitro se realizó en el laboratorio de investigación y desarrollo farmacéutico, se cumplieron de manera idónea los lineamientos de bioseguridad.^(27,28) Se utilizaron placas de Petri con agar Müller-Hinton, las cuales fueron preparadas con anterioridad según las especificaciones de la casa Merck^®.⁽²⁵⁾

Se realizaron 60 siembras y se dividieron en 4 grupos de n= 15 placas, utilizando hisopos estériles los cuales se sumergieron en los inóculos estandarizados.⁽²⁸⁾ El estriado se efectuó de forma paralela y bien compacta en toda la superficie del medio de cultivo, se repitió el proceso rotando la placa 60 ° 2 veces más y se dejó secar 10 minutos antes de disponer los discos.⁽²⁹⁾

Se elaboraron discos de papel filtro Whatman N° 3 estériles de 6 mm de diámetro, los cuales fueron colocados en los medios de cultivo mediante una pinza quirúrgica a 15 mm del borde de la placa de Petri,⁽⁵⁾tocando suave sobre el agar para facilitar su adherencia, se consideraron 4 discos por placa. Con antelación los discos fueron cargados con 32 uL de los extractos a estudiar, volúmenes que permitieron depositar 8 mg (miligramos) de extracto al 25 %, se dejaron secar y todo el proceso se llevó a cabo en un entorno estéril.⁽⁵⁾ Se dispusieron las siembras en los grupos:

Grupo I: control negativo, discos con etanol al 70 %
Grupo II: control positivo, discos con clorhexidina al 0,12 %
Grupo III: experimental 1, discos con Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth al 25 %
Grupo IV: experimental 2, discos con Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel al 25 %

Enseguida, los agares que contenían los discos se ubicaron de manera invertida en una incubadora (Memmert^®) a 37 °C por 24 h.⁽⁵⁾ Luego del período de incubación, las zonas sin desarrollo que se originaron en torno a los discos se evaluaron como halos de inhibición y se midieron con calibrador Vernier marca BullTools de 150 x 0,02 mm.^(27,28,29)

Para la evaluación de tipo cualitativa se empleó la escala de Duraffourd y para la valoración de tipo cuantitativa se usaron las zonas de los diámetros de los halos de inhibición y el porcentaje del efecto inhibitorio relativo respecto al control positivo.⁽²⁶⁾

Los resultados de los halos de inhibición fueron expresados como media aritmética ± error estándar de la media a un nivel de confianza del 95 % y un error relativo del 5 %; se utilizó la prueba de homogeneidad de varianzas de Hartley, Cochran y Bartlett; el ANOVA de una vía y el Honestly-significant-difference (HSD) de Tukey. Se consideró como nivel de significación (p< 0,05), por medio del software estadístico IBM SPSS Statistic for Windows versión 25.

El desarrollo del estudio fue aprobado por el comité de ética para la investigación de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega con la resolución 257-2019-DFCFB.

RESULTADOS

En el ensayo fitoquímico se detectaron de manera cualitativa la presencia de taninos y compuestos fenólicos en ambos extractos hidroalcohólicos (tabla 1).

Los resultados obtenidos a las 24 horas (tabla 2) indican que todos los promedios se localizan dentro de los límites determinados, a un intervalo de confianza del 95 % y un error relativo del 5 %, por este motivo no se excluye ningún dato.

De acuerdo con las medias de la tabla 2, el grupo II: control positivo, grupo III: experimental 1 y grupo IV: experimental 2 lograron valores entre 15 a 19 mm. Según la escala Duraffourd (tabla 3) se considera muy sensible (= ++) y un efecto antibacteriano alto, según el porcentaje del efecto inhibitorio sobre S. mutans ATCC 25175.

Al ejecutar el test de homogeneidad de varianzas de Hartley, Cochran y Bartlett se halló que las varianzas son iguales (p= 0,119). En la tabla 4, al efectuar el ANOVA de una vía, se determinó (p< 0,05), que denota diferencias significativas entre los grupos de ensayo sobre S. mutans ATCC 25175.

Al aplicar el post hoc HSD de Tukey, se halló que todos los grupos presentan diferencias estadísticas significativas (p< 0,05), con excepción del grupo III: bellaco caspi al 25 % con el grupo control positivo clorhexidina al 0,12 % (p= 0,631) que no muestran diferencia significativa.

DISCUSIÓN

En los últimos años se han reportado aumento de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos, debido a ello se requiere estudios de nuevos extractos, los cuales se podrían convertir en alternativa preventiva o terapéutica contra infecciones bacterianas, tal como lo son las caries dentales.^(5,9,30)

El ensayo fitoquímico preliminar realizado a Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth (ollamepan)fue semejante con lo declarado por Benites y otros,⁽²²⁾ abundantes taninos y compuestos fenólicos. Por otro lado, estos resultados no coinciden con lo reportado por Luzuriaga-Quichimbo y otros,⁽¹⁴⁾ quienes detallan que los monoterpenos y sesquiterpenos son los metabolitos secundarios mas representativos. En cuanto a Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel (bellaco caspi), los resultados del ensayo fueron semejantes con lo declarado por Posito y otros,⁽²¹⁾ pero discrepan de Soares y otros,⁽¹⁸⁾ quienes resaltan que los triterpenos son los fitoconstituyentes principales, aunque también detallaron que la especie vegetal no cuenta con la suficiente información sobre su composición química.

La revisión bibliográfica realizada en distintas bases de datos como PubMed, Scielo, Scopus, Web of Science y Science Direct (período de consulta agosto del 2021 a agosto del 2022), dio como resultado escasa información acerca de la composición química de ambas especies y no refieren investigaciones sobre el efecto antibacteriano de la corteza de bellaco caspi y hojas de ollamepan sobre S. mutans, solo se destacan sus usos tradicionales en América latina, que justifica más estudios y desarrollo de productos para aprovechar al máximo sus potenciales propiedades; lo que llevó a realizar ensayos piloto, estudiar concentraciones de extractos según estudios previos^(21,22) y realizar comparaciones con investigaciones de otras especies.^{(17,18,19,20)}

Los datos extraídos de la tabla 2 y tabla 3 reflejan que, en todos los casos, los diámetros de los halos de inhibición del grupo III con 18,660 ± 0,0948 mm (95,54 %) y grupo IV con 19,383 ± 0,0845 mm (99,24 %) fueron ligeramente menores al grupo II: control positivo, clorhexidina al 0,12 % con 19,532 ± 0,0975 mm (100 %) pero mayores al grupo I: control negativo, etanol al 70 %.

Para Cui y otros,⁽²⁾ los flavonoides son uno de los metabolitos secundarios con amplia variedad de mecanismos de acción frente a S. mutans. Farha y otros,⁽⁸⁾ indican que los taninos inhiben el crecimiento bacteriano a través de la quelación del hierro y la alteración en la síntesis de la pared celular, mientras que Kaunda y otros,⁽¹⁰⁾ resalta la importancia de los alcaloides y los compuestos fenólicos como agentes antibacterianos. Los resultados indican que los metabolitos secundarios de ambos extractos ejercieron una actividad antibacteriana sinérgica. No obstante, se consideró como resultado preliminar y es preciso establecer la base molecular del efecto sobre la cepa en estudio.

Por otro lado, el extracto de bellaco caspi presentó mayor variedad de fitoconstituyentes que ollamepan. Según Hartley, Cochran y Bartlett, las varianzas son homogéneas (p= 0,119). En relación al ANOVA de una vía y post hoc HSD de Tukey se pudo apreciar que el efecto antibacteriano de Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel (bellaco caspi) al 25 % es ligeramente superior a Hyptis obtusiflora C. Presl ex Benth (ollamepan) al 25 %.

Diversos investigadores^(14,18) han reportado que ambas especies vegetales presentan un marcado efecto antinflamatorio. Estos resultados son alentadores, para la formulación de un enjuague bucal natural y que mediante pruebas clínicas estructuradas se permita definir su eficacia real.

Se concluye que los extractos hidroalcohólicos de ambas especies tienen efecto antibacteriano in vitro sobre cepas de Streptococcus mutans ATCC 25175. Sin embargo, Himatanthus tarapotensis (K. Schum. ex Markgr.) Plumel al 25 % presenta efecto antibacteriano con valores semejantes a clorhexidina al 0,12 %.

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Conflictos de interés

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Contribuciones de los autores

Conceptualización: Héctor Alexander Vílchez Cáceda.
Curación de datos: Christhian Alexander Alvia Saldarriaga, Antonella Rosario Olortegui Quispe, Héctor Alexander Vílchez Cáceda, Ketty Rojas Berastein.
Análisis formal: Héctor Alexander Vilchez Cáceda, Ketty Rojas Berastein .
Investigación: Christhian Alexander Alvia Saldarriaga.
Metodología: Héctor Alexander Vílchez Cáceda, Christhian Alexander Alvia Saldarriaga.
Administración del proyecto: Héctor Alexander Vílchez Cáceda.
Recursos: Antonella Rosario Olortegui Quispe, Ketty Rojas Berastein.
Supervisión: Héctor Alexander Vílchez Cáceda.
Validación: Christhian Alexander Alvia Saldarriaga.
Visualización: Antonella Rosario Olortegui Quispe, Ketty Rojas Berastein.
Redacción - borrador original: Christhian Alexander Alvia Saldarriaga, Antonella Rosario Olortegui Quispe, Ketty Rojas Berastein.
Redacción - revisión y edición: Christhian Alexander Alvia Saldarriaga, Antonella Rosario Olortegui Quispe, Héctor Alexander Vílchez Cáceda.

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